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ELISA試劑盒樣本的收集和處理方法

發(fā)布時間:2017-03-30   點擊次數(shù):1971次

樣本處理方法匯總表

 

一、液體樣本

        液體樣本處理原則:所有的液體樣本,用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),如果以后碰到其他的液體樣本,也按這個方法,納入?yún)R總表。

1、血清:用無菌管收集,室溫血液自然凝固10-20分鐘,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

2、血漿:應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

3、尿液:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

4、胸腹水:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

5、腦脊液:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

6、唾液:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

7、細(xì)胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

8、牛奶:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

9、蜂蜜:用無菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

10、全血:用含有抗凝劑的無菌管收集,立即輕輕搖動,來回輕輕顛倒數(shù)次,使血液和抗凝劑混勻,以防血液凝固。

 

 

二、固體樣本

        固體樣本處理原則:稱取1g的固體樣本,用9g的合適緩沖液溶解,分泌蛋白可以直接離心取上清檢測,細(xì)胞內(nèi)的蛋白,要先收集細(xì)胞,再用合適方法破碎,離心取上清測試。

1、組織標(biāo)本:切割標(biāo)本后,稱取1g組織,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測,其余冷凍備用,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。對于植物組織,不好勻漿的話,就在液氮中充分研磨;

2、細(xì)胞內(nèi)蛋白樣本

許多待測蛋白不是分泌蛋白,而是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白,這個時候,要先收集細(xì)胞,洗滌干凈,再破碎細(xì)胞,離心取上清。

(1)培養(yǎng)的細(xì)胞

A、動物細(xì)胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液,使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融(如果反復(fù)凍融,破碎效果不好,就采用超聲波破碎),以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

B、植物細(xì)胞:用PH7.2-7.4的PBS稀釋細(xì)胞懸液,使細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,置于冰盒上,用超聲破碎儀,設(shè)置破碎2s,冷卻30s的方式,充分破碎細(xì)胞,以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

(2)組織的細(xì)胞

切割標(biāo)本后,稱取1g組織,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),去除上清,再用pH7.2-7.4左右的PBS小心洗滌沉淀的細(xì)胞三遍。再用上述的細(xì)胞破碎方法破碎細(xì)胞。

3、土壤:稱取1g土壤,加入9g的pH7.2-7.4左右的PBS,用手工將標(biāo)本充分混勻。2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測,其余冷凍備用,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白,直接取上清檢測,測試細(xì)胞內(nèi)蛋白,要破碎細(xì)胞。

4、咽拭子:加入2g的pH7.2-7.4左右的PBS,溶解咽拭子頭部,搖勻,用鑷子取出咽拭子并擠干液體,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分),仔細(xì)收集上清。分裝一份待檢測,其余冷凍備用,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。如果是測分泌蛋白,直接取上清檢測,測試細(xì)胞內(nèi)蛋白,要破碎細(xì)胞。

 

6.植物標(biāo)本中相關(guān)酶或蛋白的測定:(粗提?。?/span>
1、 新鮮植物組織請在液氮中充分研磨;
2、 加入樣品體積9倍的提取液(pH 7.4 PBS緩沖液),

3、 請于4度,8000rpm,離心30分鐘,取上清并暫時保存于4度待用。

 

 

三、樣本收集注意事項

1、不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

2、標(biāo)本采集后盡快進(jìn)行實驗,若不能馬上進(jìn)行試驗,可將標(biāo)本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3、我們羅列的是通用的樣本處理方法,無法涵蓋各種樣本,對于一些特殊樣本,建議實驗人員多參考已發(fā)表的文獻(xiàn),自行設(shè)計合理的樣本處理方法。

計算方法示例:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:在Excel工作表中,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,按曲線方程計算各樣本濃度值。將樣本的OD值為X值代入方程式,所得的Y值即是我們的樣本值。(如上圖所示)

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